REAGEN 黄曲霉B1检测试剂盒说明书
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REAGEN™黄曲霉毒素B1检测试剂盒
RNM98007
1．概述
REAGEN™黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒是用于检测谷类，饲料，饼干，牛奶，花生，植物油中黄曲霉毒素B1的残留。该试剂盒特点包括：
Ø 高回收率（75-125%），快速（10-40分钟）。
Ø 高灵敏度（0.02ng/g或ppb）
Ø 高重现性。
Ø 快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需1小时）。
2．试剂盒原理
REAGEN™黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品、酶标物以及抗体加入孔中，如果样品中含有毒素，会与微孔板上的抗原竞争抗体，同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中毒素的含量成反比。
3.试剂盒组成
内容物 | 规格 | 保存 |
黄曲霉B1包被板(Aflatoxin B1-BSA-Coated Plate) | 96孔板（12×8 孔） | 2-8℃ |
黄曲霉毒素B1标准品(Standards)： 0ng/ml阴性质控(Negative control) 0.02ng/ml 0.06ng/ml 0.2ng/ml 0.6ng/ml 1.5ng/ml |
1.0mL 1.0mL 1.0mL 1.0mL 1.0mL 1.0mL | 2-8℃ |
B1一抗 (Antibody #1) | 6mL | 2-8℃ |
酶标二抗(HRP-Conjugated Antibody #2) | 6mL | 2-8℃ |
20×浓缩洗液(Wash Solution) | 30mL | 2-8℃ |
10×样本稀释液(Sample Dilution Buffer) | 25mL | 2-8℃ |
终止液(Stop Buffer) | 12mL | 2-8℃ |
TMB底物(TMB Substrate) | 12mL | 2-8℃ |
本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。
4.检测限
检测物质 | 检测下限（ng/g） |
牛奶 /奶粉 | 0.04/0.1 |
谷物, 饲料, 种子 、饼干 | 0.5 |
植物油 | 0.2 |
5.交叉反应
药物 | 交叉反应率（%） |
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1) | 100 |
黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2) | 49 |
黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1) | 37 |
黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2) | 8 |
6．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料
1) 酶标仪(450nm)
2) 匀质器
3) 漩涡振荡器 离心机
4) 微量加样器(10、20、100和1000mL各一支)
5) 多道枪：50-300mL
6) 甲醇
7.注意事项
实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。
1) 标准品中含有黄曲霉毒素B1，请小心使用。
2) 不要使用过期的试剂盒。
3) 不同批次的试剂盒不要混用，酶标物和微孔板具有盒与批次的特异性。
4) 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。
6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。
7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。
8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。
9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。
8．样品的准备
样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20℃。样品使用前应恢复到室温。（配制试剂时都需要充分混匀）
1. 配制1x洗液
1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合
2. 配制70% 甲醇
加入7 体积100% 甲醇到 3 体积蒸馏水.
3. 配制试剂A
3 体积100% 甲醇 加入7 体积1X 洗液.
4. 配制1x样品稀释液
1 体积10X 样品稀释液 加入 9 体积蒸馏水.
5. 配制30% 甲醇
加入3 体积100% 甲醇到 7 体积蒸馏水.
*可以等比例增加样品量和相关提取液；也可以根据样品浓度调整稀释倍数
牛奶
1) 取1 mL 牛奶, 加 1 mL 试剂A.，涡旋1 分钟.
2) 离心 5 分钟 4,000 x g ，室温 (20 – 25℃ / 68 – 77°F).
3) 取50 µL 清液用于检测
稀释倍数= 2
奶粉
1) 1 g 奶粉，加入 2mL 70%甲醇水， 涡旋 5 分钟；
2) 离心 5 分钟 4,000 x g ，室温 (20 – 25℃ / 68 – 77°F).；
3) 取200 µL 上清液加300 µL 1X 样品稀释液，混匀；
4) 取50 µL用于检测
稀释倍数= 5
谷物, 饲料, 种子 ,饼干
粉碎适量样品
1) 称1 g 粉碎样品；
2) 加入5 mL 70% 甲醇，涡旋 3 分钟 ；
3) 离心 5 分钟 4,000 x g ，室温 (20 – 25℃ / 68 – 77°F)；
4) 取 200 µL 上清，加入800 µL 蒸馏水. 混匀1分钟；
5) 取50 µL 样品液检测
稀释倍数=25
*可以等比例增加样品量和相关提取液；也可以根据样品浓度调整稀释倍数
蔬菜/豆类/花生/植物油
1) 称取1.0g样品，加入5mL 30%的甲醇；
2) 高速涡流2分钟，加入3mL正己烷，高速涡流2分钟；
3) 室温下4000 x g离心5分钟；
4) 去除上层正己烷，取500μL下层澄清液加入500μL 1x样品稀释液. 混匀.
取50 µL 样品液检测.
稀释倍数：10
9．酶联免疫反应测试步骤
试剂准备
注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。
检测：
以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
试剂 | 每个反应需要的体积 | 24次反应的体积 |
抗体 | 50 mL | 1.2 mL |
酶标物 | 50 mL | 1.2 mL |
工作洗液 | 1 mL | 24 mL |
终止液 | 100 mL | 2.4 mL |
底物 | 100 mL | 2.4 mL |
（1） 加入50mL的标准液于所设定的孔中；
（2） 加入50mL的样品于所设定的孔中；
（3） 在每孔中加入50mL酶标二抗；
（4） 在每孔中加入50mL抗体， 轻敲微孔板边缘混匀30秒；
（5） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟；
（6） 洗板4次，每次加入250mL 1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（7） 每孔加入100mL的TMB底物，用手敲板边缘1分钟混合均匀
（8） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育10分钟， 加入100mL的终止液终止反应。
（9） 在450nm下读OD值(读数前，用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。
10．结果计算
（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
（2） 相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100
（3） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。
（4） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法进行确证。
以下曲线图是黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线
